一、细胞准备篇

1、 组织消化选择什么消化液，消化多长时间？
答：组织的消化液有两种，一种是 EDTA, 另一种是胶原酶，EDTA 适合消化空腔性器官，例如小肠和胃；胶原酶消化应该比较广泛，一般会搭配 DNA 酶一起使用，基本适合所有组织的消化。不同组织消化时间差异比较大，从十几分钟到数时小时都有。
2、 消化的温度如何选择？
答：EDTA 消化可以在冰上进行，胶原酶的消化需要 37℃，这样酶的活性最高。
3、 基质胶培养之前，如何筛出干性细胞？
答：如果是单细胞，并且已知干细胞的特异性标记，可以通过流式分选或者磁珠分选。
4、 类器官的培养必须要细胞具有干性吗？正常组织成熟体细胞可以做类器官培养吗？
答：只有干细胞扩增来源的培养物才能称之为类器官，因此干性是必要条件。正常组织的成熟体细胞中往往会有一部分成体干细胞( 标志物为 Lgr5，CD133 等 ), 这部分细胞可以进行类器官培养。
5、 如何选择构建类器官的来源细胞？
答：理论上所有类器官都可以选择从ESC/IPSC 来构建，部分类器官可以选择从组织中分离成体干细胞来构建，成体干细胞来源的类器官其构建周期短，体外传代次数多，相对而言构建成本低；根据实验需求，如果要通过类器官模型来研究器官的发育，需要对起始细胞进行基因编辑，一般都是通过ESC/IPSC 来构建类器官。

二、类器官培养篇

1、 类器官培养需要多长时间？
答：如果选择从 ESC/IPSC 来构建类器官，需要 1-2 月 ( 甚至更长 ) 才能构建成功，如果是选择从成体干细胞来构建类器官，一般只需要 1-2 周就可构建成功。
2、 基质胶如何重悬细胞？
答：用基质胶去混细胞时，可以直接用基质胶去重悬细胞；也可以用培养基：基质胶=1:1 的比例稀释后重悬细胞，但是不推荐更大比例稀释基质胶，因为加入过多的培养基时，胶滴容易散开，整个重悬过程在冰上操作，重悬细胞时禁止产生气泡。
3、 不同孔板培养类器官培养所需的基质胶和培养基？
答：类器官常用 24 孔板进行培养，一般种一个 50μl 的胶滴，加入 500μl 培养基覆盖胶滴；6 孔板可以种多个 50μl 的胶滴，加入 2ml 培养基覆盖胶滴；96 孔板一般种一个 10μl 的胶滴，加入 200 μl 培养基覆盖胶滴。
4、 基质胶可否反复冻融？
答：基质胶不建议反复冻融，偶尔冻融一两次没问题，多次冻融会有影响，但是要注意，基质胶凝固后不建议再用了。

三、类器官传代篇

1、类器官传代时如何收获类器官？如何将类器
官分散开？
答：基质胶在 4℃时会变得很软，吹打后可将基质胶分散开，通过离心去除上清液里的基质胶，收集的类器官重悬后可通过机械力吹打进行解离；也可以选择用 Cell recovery solution 来消化基质胶，使基质胶溶解，通过离心去除上清液里的基质胶，Cell recovery solution 对细胞团消化作用不明显，因此更多时候类器官传代需要使用消化酶 ( 包括胰酶 ) 消化成单细胞或小细胞团。
2、类器官传代一般怎么传啊？
答：先把基质胶消化掉，可以对类器官消化 ( 消化酶处理 ) 或不消化 ( 机械力吹打 )。传代通常按照 1:2、1:3、1:4 甚至 1:10 的比例都有传代成功的例子。需要 37℃，这样酶的活性最高。
3、如果传代，有没有对第一代类器官数量的要求？
答：由于传代过程中类器官会有损失，因此类器官传代时对前一代理论上有一定的数量要求，如类器官数量较少、尺寸较小、活性较差等都会影响传代培养效果。类器官传代须在类器官数量较多，且细胞状态较好时进行。传代时酶解或吹打尽量轻柔以免损伤细胞。并且传代操作时尽量避免反复操作以免造成较大的细胞损失。

四、肿瘤类器官篇

1、 肿瘤类器官的培养是否也会生成正常的类器官，是否会影响药敏测试的结果？
答：肿瘤类器官来源即为肿瘤组织，即使存在部分正常细胞，也是肿瘤微环境的一部分，且正常细胞的干性、增殖能力弱于肿瘤细胞，因此类器官建立后其大部分细胞为肿瘤细胞，少数正常细胞基本不会影响药敏测试。
2、 培养肿瘤类器官需要原始肿瘤组织的大小是多少？活检样本量足够吗？
答：肿瘤类器官培养所需手术组织大概需要3 颗黄豆大小以上，穿刺活检样本需要至少 3针，内镜活检至少钳取 6 颗以上。因肿瘤异质性较大，建议可以取肿瘤组织不同部位分别进行类器官培养。
3、 肿瘤类器官培养后能否建系？
答：部分肿瘤类器官是具有长期培养和稳定传代的能力的，这类类器官可用于建系，但不是所有类器官都可以建系。

五、类器官鉴定篇

1. 如何去鉴定培养的类器官是否成功 ?
答：看类器官大小、结构以及是否具有特殊形态。一般初次培养，最好进行 HE、免疫荧光、基因测序鉴定。

参考文献：

1. Co-culture With Intestinal Epithelial organoids allows efficient expansion and motility analysis of intraepithelial lymphocytes ;
2. single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche ;
3. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids ;
4. Differentiation of human intestinal organoids with endogenous vascular endothelial cells ;
5. Modeling human development and disease in pluripotent stem cell-derived gastric organoids ;
6. In Vitro Expansion of Human Gastric Epithelial Stem Cells and Their Responses to Bacterial Infection ;
7. Lgr5+ve Stem Cells Drive Self-Renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro ;

8. The use of murine-derived fundic organoids in studies of gastric physiology .

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