小肠、胃类器官的免疫荧光染色方法

1、吸去培养板孔内的培养液，用 PBS 清洗三次，弃去 PBS；
2、往基质胶孔内加入 4%多聚甲醛固定 15 min；
3、用 PBS 清洗三次，用亚甲基蓝将基质胶染色以便于辨认；
4、再用 PBS 清洗二次，将类器官从 24 孔培养板内轻轻刮下来，保持基质胶的完整性；
5、将基质胶与包埋剂混合装入自制小龛（锡箔纸制作）中，-80℃冻存；
6、进行冰冻切片，厚度为 6 μm/ 张；
7、冰冻切片 55℃烤箱放置 2 h 后，将类器官所在位置周边画一蜡圈标记，用 PBS 清洗三次，每次 5 min；
8、封 闭 30 min，封 闭 液 为 含 10% 羊 血 清、0.3%TritonX-100 的 PBS 溶液；
9、孵育一抗（根据说明书上的稀释比例进行稀释），放于 4℃冰箱，孵育过夜；
10、第二天，将玻片拿出，用 PBS 清洗，每次 5min，共 3 次；
11、根据一抗的种属情况，选择不同的荧光二抗进行避光孵育，荧光二抗稀释比例为 1：200，孵育时间为 1h；
12、用 PBS 清洗，每次 5 min，共三次；
13、避光孵育核染料 Hoechst 染细胞核（稀释比例为 1:1000），时间为 15 min。注意避光操作；
14、用 PBS 清洗，每次 5 min，共三次；
15、用 50% 甘油封片，荧光显微镜观察荧光染色情况，进行拍照。

流式染色样本处理方法

1、将培养培养板孔内培养液吸尽；
2、取 Cell Recovery Solution 溶液按 0.5 ml/ 孔（24 孔板）加入孔板内，用枪尖刮下基质胶，吹打数下，转入 15 ml 离心管内，冰上静置 20min后，置 入 4℃离 心 机 离 心 5 min，转 速 为 1000rpm，吸掉上层 Cell Recovery Solution 溶液；
3、加入胰酶消化类器官，37℃孵育 10 min，间断用枪头轻柔吹打为单细胞悬液（可将类器官放回培养板孔内进行消化，期间有利于观察消化情况）；
4、用 10%FBS 终止消化，用 40 μm 滤网过滤掉碎片或细胞团块。 300g/ 5min 离心，再用 PBS 洗涤一次，再以 300g /5 min 离心；

5、离心完后弃去上清液，PBS 重悬细胞计数，取 1*106 细胞进行流式染色。

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