小肠、胃类器官的免疫荧光染色方法
1、吸去培养板孔内的培养液,用 PBS 清洗三次,弃去 PBS;
2、往基质胶孔内加入 4%多聚甲醛固定 15 min;
3、用 PBS 清洗三次,用亚甲基蓝将基质胶染色以便于辨认;
4、再用 PBS 清洗二次,将类器官从 24 孔培养板内轻轻刮下来,保持基质胶的完整性;
5、将基质胶与包埋剂混合装入自制小龛(锡箔纸制作)中,-80℃冻存;
6、进行冰冻切片,厚度为 6 μm/ 张;
7、冰冻切片 55℃烤箱放置 2 h 后,将类器官所在位置周边画一蜡圈标记,用 PBS 清洗三次,每次 5 min;
8、封 闭 30 min,封 闭 液 为 含 10% 羊 血 清、0.3%TritonX-100 的 PBS 溶液;
9、孵育一抗(根据说明书上的稀释比例进行稀释),放于 4℃冰箱,孵育过夜;
10、第二天,将玻片拿出,用 PBS 清洗,每次 5min,共 3 次;
11、根据一抗的种属情况,选择不同的荧光二抗进行避光孵育,荧光二抗稀释比例为 1:200,孵育时间为 1h;
12、用 PBS 清洗,每次 5 min,共三次;
13、避光孵育核染料 Hoechst 染细胞核(稀释比例为 1:1000),时间为 15 min。注意避光操作;
14、用 PBS 清洗,每次 5 min,共三次;
15、用 50% 甘油封片,荧光显微镜观察荧光染色情况,进行拍照。
流式染色样本处理方法
1、将培养培养板孔内培养液吸尽;
2、取 Cell Recovery Solution 溶液按 0.5 ml/ 孔(24 孔板)加入孔板内,用枪尖刮下基质胶,吹打数下,转入 15 ml 离心管内,冰上静置 20min后,置 入 4℃离 心 机 离 心 5 min,转 速 为 1000rpm,吸掉上层 Cell Recovery Solution 溶液;
3、加入胰酶消化类器官,37℃孵育 10 min,间断用枪头轻柔吹打为单细胞悬液(可将类器官放回培养板孔内进行消化,期间有利于观察消化情况);
4、用 10%FBS 终止消化,用 40 μm 滤网过滤掉碎片或细胞团块。 300g/ 5min 离心,再用 PBS 洗涤一次,再以 300g /5 min 离心;
5、离心完后弃去上清液,PBS 重悬细胞计数,取 1*106 细胞进行流式染色。
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