胃类器官是一种衍生于胃干细胞或者多能诱导干细胞的类器官模型，体外培养的胃类器官含有多种细胞克隆亚群，其培养环境模拟活体内的真实微环境，因此胃类器官在细胞成分、组织构架及特定功能等方面与胃上皮组织高度相似，可实现在体外培养环境中对胃上皮组织的复制，为人类胃生理与疾病的研究提供了一个新的平台。胃上皮类器官培养的原理就是3D环境下培养胃上皮干细胞，加入生长因子和小分子刺激干细胞自发分裂、分化形成球囊状结构。胃上皮腺体可分为胃底/体腺和胃窦/幽门腺两部分，胃底腺和胃窦腺均可构建胃上皮类器官，其中含有的细胞成分与各自上皮一致。胃类器官是一种非常好的基础实验模型，目前已被应用于胃的形成与生理、幽门螺杆菌感染相关疾病、胃疾病的致病基因研究、药物筛选与开发以及再生医学等领域。

胃类器官的制备方法

1、小鼠腹腔麻醉后以颈椎脱臼法处死，剖腹，分离胃移至置于冰上的培养皿中。

2、沿胃大弯侧剪开胃壁，冰 PBS 冲洗并分离胃体部。去除胃肌层，将剩下的上皮层剪成直径小于 2 mm 大小的碎片。用 10 ml 的移液管将组织碎片的移至 15 ml 离心管中，添加 10 ml 冰 PBS反复吹打重悬，然后让组织碎片自然沉降于管底，弃去约 7.5 ml 的上清。

3、重复该重悬清洗步骤 5～10 次至上清液清亮，弃上清。
4、最后一次漂洗后，吸除大部分上清液，向沉淀中加入含 10 mM EDTA 溶液 (25 ml) 室温消化60 min 后，弃上清。
5、加入 10 ml 冰 PBS 用移液管轻轻吹打几次，等待组织块沉淀下去，弃去上清，将组织块转移到 10 cm2 的培养皿中，在组织块上覆盖一个无菌的载玻片，戴上无菌手套，用两手的大拇指按压载玻片，将组织块腺体中的细胞挤压出来。
6、加入 PBS 反复吹打培养皿和载玻片上的组织块，吹打后等待组织块自然沉降，小心吸取上清液并使用 70 μm 滤网过滤，将滤液收集于干净的50 ml 管中。
7、如果收集的细胞不够多，可以重复5)和6)步骤，将几份混合液以 200×g 离心 5 min。小心地倒出并丢弃上清液。

配置类器官培养基

在基础培养基中加入(如下表所示)：

培养基中加入的组分及工作浓度

N2 Supplement	1x
B27 serum-free supplement	1x
Murine EGF	100 ng/mL
Murine R-spondin 1	200 ng/mL
Murine Noggin	100 ng/mL
Wnt -3A	100 ng/ml
FGF10	100 ng/ml
N–acetylcysteine	1 mM
Gastrin I	10 nM
Y-27632	10 μM

8、将沉淀重悬于含有冰的类器官培养基中，吸取 10 μL 置于玻璃载玻片或血细胞计数器上。使用倒置显微镜，计数分离的细胞数目，200 g 离心 5 min，小心吸出并弃去上清。用类器官培养基重悬细胞至 1.6 x105 个 /ml。
9、将离心管置于冰上，吸取 150 μL 重悬好的细胞悬液，加入等体积的预冷的 Matrigel，小心地上下吹打十次以充分混匀，注意避免产生气泡。
10、吸取 50 μL 悬液，加入到提前预热的 24 孔板每个孔中的中心部位，样品应在每个孔的中心形成圆顶结构。为了防止接种时出现气泡，枪头内液体不要全部打出。分别接种 24 孔板 4 个孔。
11、将培养板在 37℃下静置 10 分钟以待基质胶完全凝固。将平板转放入培养箱时，应注意不要破坏凝固后的液滴。
12、使用移液枪沿着孔侧壁向每个孔中轻轻地加入500 μL室温(15-25℃)的配置的类器官培养基。不要将培养基从圆顶结构上直接加入。
13、向其它未接种的孔中加入无菌 PBS 以保证培养时的湿度。
14、将培养板的盖子盖好，并在 37℃和 5％CO2下进行培养。
15、每隔 2 天进行完全换液。换液时将移液枪头放在孔底边缘小心地将原有液体培养基吸出，并加入为 500 μL 新鲜的室温类器官培养基。

16、在培养第 7 至 10 天以 1:3~1:6 的比例进行类器官传代，以避免在类器官过度生长和空腔内积累过量的碎屑。

小鼠胃类器官的传代

1、在成熟类器官的24孔板中，每孔加入约1000 基础培养基，使用无菌细胞刮刮取孔板中的基质胶，收集每个孔中的悬液置于 15 ml 离心管中；
2、将可以传代的类器官冰上放置 5 ～ 10 min；用 1 ml 大枪头吹打将基质胶打碎，吹打 30 下左右，此过程避免产生气泡（调制量程到 700 μL可避免气泡产生），可取适量的悬液观察，直至大部分类器官结构解离。其后步骤同胃类器官的制备方法中 9 ～ 13。
注：传代中，若隐窝状态良好可进行 1:3 传代，若状态较差可进行 1:1 传代。全程可以维持约 3 个月的长期传代扩增，且类器官状态保持良好。

小鼠胃类器官的培养注意事项

1、胃解剖上可分为胃底、胃体、胃窦、幽门（小鼠胃还拥有前胃部分），对应的胃上皮可以分为胃底 / 体腺和胃窦 / 幽门腺两部分，两者在细胞构成上差别较大。它们均含有表面黏液细胞、颈粘液细胞、干细胞、内分泌细胞；但胃底腺含有壁细胞（分泌盐酸）和主细胞（分泌胃蛋白酶），而胃窦腺不含有这两种细胞组分。胃底腺和胃窦腺均可以构建成胃上皮类器官。胃腺体内的干细胞能够分裂、分化，自发形成球囊状结构；囊壁上含有所有腺体内的细胞成分。囊内为上皮的腔面，内含脱落细胞、分泌物等；囊外为上皮的基底面，为细胞外基质成分。

2、EDTA 消化液需要用无钙无镁的 PBS 溶液进行稀释，否则影响 EDTA 的螯合作用。

胃类器官的培养相关试剂及使用浓度

品牌	货号	产品名称	使用浓度	规格
BioGems	6169116	N-Acetyl-L-cysteine	1 mM	10 g/100g
BioGems	1003377	Gastrin I	10 nM	1 mg
BioGems	1293823	Y-27632	10 μM	1 mg/10 mg
PeproTech	315-09	Murine EGF	50 ng/ml	100 μg/500 μg/1mg
PeproTech	250-38	Murine Noggin	100 ng/ml	5 μg/20 μg/50 μg/100 μg/250 μg/500 μg/1mg
PeproTech	315-32	Murine R-Spondin-1	100~500 ng/ml	5 μg/20 μg/50 μg/100 μg/250 μg/500 μg/1mg
PeproTech	450-61	Murine FGF-10	100 ng/ml	5 μg/25 μg/100 μg/250 μg/500 μg/1mg
PeproTech	315-20	Murine Wnt3a	100 ng/ml	2 μg/10 μg

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