2009年，荷兰科学家Hans Clevers的团队成功地在体外将Lgr5+肠道干细胞培养成包括隐窝样区域和绒毛样上皮区域的三维结构，即小肠类器官，这一结构包含所有终末分化细胞类型，能准确模拟肠道上皮生理情况，这一方法的建立既实现了肠上皮长期体外培养又可以维持肠上皮细胞原始分化能力，该技术已经逐渐被应用于干细胞、疾病模型以及再生药物等相关研究。小肠类器官的培养可以通过多能诱导干细胞或胚胎干细胞来诱导分化，也可以取小肠的隐窝干细胞来诱导分化，目前大多数研究都是采用小肠隐窝干细胞来培养，因为该方法不仅获取干细胞方便，技术要求不高，而且培养的类器官传代次数更多，可以在体外长期培养长达2个月之久。

在进行小肠类器官培养时需要将整个隐窝结构或者单个Lar5+干细胞种植到基质胶中，然后利用无血清培养基进行培养，培养基中含有三种必须的细胞因子，即R-spondin1、EGF、Noggin。其中 R-Spondin1是Wnt通路的激动剂，同时也是Lgr5的配体，在体内可以导致隐窝的大量增殖;EGF与受体结合可以促进小肠上皮细胞的增殖:Noaain是BMP通路的抑制剂，可以增加类器官中隐窝的数量。通过这种方法培养出来的类器官，可以得到上皮细胞紧密连接形成中空的管腔样结构，腔内有凋亡脱落下的细胞。随着类器官的生长，干细胞可通过出芽的方式向外突出生长形成更多的隐窝状结构。培养的类器官中含有各种肠道细胞，目各细胞比例与体内一至，潘氏细胞和内分泌细胞也可以向腔内分泌物质，吸收细胞也具备吸收功能。

小肠类器官的制备方法

1、将小鼠断颈处死后，收集自末端回肠起约15cm肠断，置于冰的PBS 洗涤液液中，使用尖头镊子去除肠道外部的膜、血管和脂肪，用注射器从小肠一端注入PBS进行冲洗；
2、使用小剪刀，将肠段纵向切开，肠腔朝上打开。用冰冷的PBS（2-8℃）轻轻洗涤切开的肠道片段，用玻片刮出肠管内容物和绒毛结构，再次用冰冷的PBS冲洗；
3、向50 mL离心管中加入15 mL冰冷的PBS。用镊子夹住肠道一端，并悬在管口上。从肠道底部开始，用剪刀将肠切成1~2毫米的小片，让这些碎片落入管内的缓冲液中；
4、用PBS预先润湿10 mL移液管，加入15 mL冰冷的PBS清洗肠道碎片5~10次，直至上清液变澄清(见图1)；
5、除去上清液，将组织碎片重悬于 25 mL 小肠隐窝消化液中，在冰上孵育 20min，冰盒置于 20rpm 转速摇床上旋转 30 min；小肠隐窝消化液：2-5 mM的EDTA, 此步骤后可以让组织碎片自然沉降后去除上清，继续消化一次。
6、让组织碎片通过重力沉降约1 min。小心吸出并丢弃消化液，留下足够的液体以没过组织碎片；
7、将组织碎片重悬于 10 mL10%FBS 冷的 (2-8℃)PBS 缓冲液，并用移液管上下吹打三次。静置直到大部分肠组织碎片沉降到底部 ( 见图 2)；
8、小心吸取上清液并使用 70 μm 滤网过滤，将滤液收集于干净的 50 mL 管中；
9、重复上述 7-8 步骤二次，将获得的三份过滤液混合；
10、在 2-8 ℃下将上述混合液以 290×g 离心 5 分钟。小心地倒出并丢弃上清液；
11、将沉淀重悬于含有 10 mLPBS 缓冲液中。200×g 离心 3 分钟。轻轻倒出上清液。将肠隐窝沉淀留在管中。根据沉淀量加入适当体积的基础培 养 基 重 悬 沉 淀，如 果 单 细 胞 过 多，可 200 r/min 离心 2 min 收集上清以去除单细胞；
12、计数，吸取 10 μL 置于玻璃载玻片或血细胞计数器上。使用倒置显微镜，计数 10 μL 样本中的隐窝数量，200 g 离心 5 min，小心吸出并弃去上清；

配置类器官培养基

培养基中加入的组分及工作浓度

N2 Supplement	1x
B27 serum-free supplement	1x
Murine EGF	100 ng/mL
Murine R-spondin 1	200 ng/mL
Murine Noggin	100 ng/mL
N–acetylcysteine	1 mM

注：基础培养基应为 Advanced DMEM-F12( 含有10mM HEPES、L- 谷氨酰胺 )

图1：小肠组织清洗澄清后的上清液                                                                   图2：吹打后的小肠上清液，含有小肠隐窝

13、用类器官培养基将隐窝的密度重悬至 8-20个 /μL，取出 150 μL 隐窝悬液，加入等体积的未稀释的基质胶混合隐窝，小心地上下吹打十次以充分混匀，注意避免产生气泡；
14、吸取 50 μL 悬液，加入到提前预热的 24 孔板每个孔中的中心部位，样品应在每个孔的中心形成圆顶结构。为了防止接种时出现气泡，枪头内液体不要全部打出；
15、将培养板在 37℃下静置 10 分钟以待基质胶完全凝固。将平板转放入培养箱时，应注意不要破坏凝固后的液滴；

图3：基质胶种板后的形成的液体

16、使用移液枪沿着孔侧壁向每个孔中轻轻地加入 500 μL 配置的类器官培养基，室温 (15-25℃)。不要将培养基从圆顶结构上直接加入；
17、向其它未接种的孔中加入无菌 PBS 以保证培 养 时 的 湿 度。将培养板的盖子盖好，并在37 ℃和5％CO2 下进行培养；
18、观测类器官生长情况。通常，隐窝开始培养约 3 小时后形成球状结构，通常在培养 2 至 4 天后，小肠类器官开始出芽，并且在第 5 至 7 天形成复杂的出芽状结构；
19、隔天进行完全换液。换液时将移液枪头放在孔底边缘小心地将原有液体培养基吸出，并加入500 μL 新鲜的室温类器官培养基。

图4：培养10天后的小肠类器官

小肠类器官培养注意事项

1、肠道外部的膜、血管和脂肪，尽量去除干净，否则后续得到的分馏会有很多杂细胞污染；
2、用注射器往肠腔内注入 PBS，冲洗掉小肠内容物，可以减少后续洗涤时间；
3、用无菌的载玻片刮去小肠内绒毛组织，尽量去除干净，可以减少杂细胞的产生，另外可以有助于小肠组织的消化，得到更多的小肠隐窝；
4、小 肠 隐 窝 消 化 液 用 5 mM 的 EDTA，注意EDTA 是否有析出，如析出太多会影响终浓度，有必要更换新的 EDTA；
5、因分离小肠隐窝需要时间较久，建议整个操作在低温进行，离心机调至 4℃，PBS 放冰上。试用移液器前用冷的 PBS 润洗移液器枪头；
6、EDTA 消化后，小肠组织会变松散，在外界机械力作用下，小肠隐窝会从组织中分离出来，可以重复几次通过外界机械力作用得到不同的分馏组分，可以挑选隐窝含量较高，杂细胞较少的分馏组分种板培养；
7、得到分馏组分后进行隐窝计数，用完全培养基重悬隐窝至 8~20 个 /μL，加入等体积基质胶混合，该过程一定要在冰上操作，混合过程切勿产生气泡，否则影响后续观察以及隐窝培养状态，混匀过程可以调小量程，吸取的液体不要全部吹出；
8、购买的基质胶在冰上融化后分装冻存，操作过程中基质胶一定要放在冰上，未用完的液体状基质胶可以冻存，若凝固后请弃去。
9、基质胶种板前需要将培养板放入培养箱温浴30min，拿出培养板后尽快种板，以便形成更好的基质胶圆顶结构。

小肠类器官的传代培养

1、在成熟类器官的24孔板中，每孔加入约1000基础培养基，用1mL 枪头吹打板底的基质胶，直到基质胶全部打碎，收集每个孔中的悬液置于15 mL离心管中；
2、将全部打碎的基质胶悬液冰上放置 5 ～10min；可用 1 mL 大枪头继续吹打悬液，此过程避免产生气泡（调制量程到 700 μL 可避免气泡产生），可取适量的悬液观察，直至看不到大块的类器官团块为止；

图5：小肠隐窝干细胞在基质胶中培养7天结果

图6：小肠类器官传代在基质胶中培养3天结果

注：此过程也可将全部打碎的基质胶悬液吸入胰岛素注射器内，再将悬液通过胰岛素注射器针头打出，通过机械力将类器官团块分离。
传代中，若隐窝状态良好可进行 1:3 传代，若状态较差可进行 1:1 传代。全程可以维持约 3 个月的长期传代扩增，且类器官状态保持良好。

小肠类器官的冻存与复苏

准备冻存液：10％二甲基亚砜 (DMSO)+20％胎牛血清 (FBS)+70％DMEM/F12
1、将需要冻存的类器官冰上放置 5 ～ 10 min；
2、收集类器官，步骤同之前传代收集步骤一致；
3、离心后弃上清，用 800μl 的冻存培养液重悬，将悬液移至冻存管中，放入冻存盒中于 -80℃冰箱中保存 24 h，如需长久保存，则 24h 后转移至液氮罐保存。

复苏准备：37 ℃水浴箱
从液氮中取出冻存管后，立即放入 37 ℃水浴中，使之迅速融解。等到冻存管中仅存一小片冰室，迅速将细胞转移到含 9 mL 冷的基础培养基中 ( 先将之置于 15 mL 离心管中，放于冰上 )。200 g室温离心 5 min，弃去上清，加入适量类器官培基重悬后与基质胶混合种板，待基质胶凝固后加入类器官培养基，将培养板放入培养箱。

小肠类器官培养用相关试剂

品牌	货号	产品名称	使用浓度	规格
BioGems	6169116	N-Acetyl-L-cysteine	1 mM	10 g/100g
PeproTech	315-09	Murine EGF	100 ng/mL	100 μg/500 μg/1mg
PeproTech	250-38	Murine Noggin	100 ng/mL	5 μg/20 μg/50 μg/100 μg/250 μg/500 μg/1mg
PeproTech	315-32	Murine R-Spondin-1	200~500 ng/mL	5 μg/20 μg/50 μg/100 μg/250 μg/500 μg/1mg

小鼠小肠类器官培养操作视频参考：

电话 | 0512-6856 7071