一、 分离小鼠结肠隐窝

       1、腹腔麻醉后采用颈椎脱臼法处死小鼠，浸泡于体积分数为 75%的酒精中 5 min；解剖小鼠取结肠 5cm（结肠取材应从盲肠下方 0.5 cm，直肠上方 0.5 cm 位置截取），将肠段放入 10cm 培养皿中，里面提前加入预冷（2~8 ℃）的 10ml DPBS 溶液;
       2、使用钝头剪刀将肠段纵向剖开，用弯镊刮去肠壁上附着的粪便残渣，加入 DPBS 溶液彻底冲洗肠段；用手术刀将肠切成4 mm左右的小段，转移至50 mL离心管中用预冷DPBS溶液反复清洗 10 次以上（可选择性加入双抗和两性霉素 B）；
       3、加入 10 mL 消化液（DMEM 加入 1% FBS，加入 500U/ml collagenase XI，0.4U/ml dispase 和 1 mM DTT），37℃水浴消化 15~25min；
       4、自然沉降细胞后，吸去消化液，留有管底的细胞和组织碎片，加入 10 mL 含有质量分数 0.1% BSA 的冰 DPBS 溶液，用巴氏吸管吹打重悬 3 次，待其自然沉降后，收集上清液并标记为“上清 1”，重复上述操作，分别获得“上清 2-8”；吸取各上清组分 1mL 到 12 孔板中，镜检，选取细胞碎片与杂质少的上清组分合并到一管，其余上清组分舍弃，并用 70μm 的细胞筛网过滤合并上清液，4℃ 200 g/min 离心 5 min，小心弃去上清，留在管底的沉淀即为小鼠结肠隐窝。

二、 分离的小鼠结肠隐窝类器官培养

       1、向获取的隐窝沉淀中加入 10 mL 冰 DMEM/F12 培养基重悬；取出 10 μl 滴加于载玻片上计数隐窝，以 24 孔板为例，每孔含 500 个隐窝;
       2、取出相应数量的隐窝悬液，离心去除干净上清后，用未经稀释的 Matrigel® 基质胶重悬隐窝到对应体积，吸取 50 μl 混悬液，加入提前 37℃预热的 24 孔板的孔中心部位，将培养板在 37 ℃下静置 10 min 以待 Matrigel®完全凝固；
       3、 使用移液枪沿着孔侧壁向每个孔中轻轻地加入 500 μl 预热的配置好的类器官生长培养基，其他未接种孔加入无菌 PBS，以保持培养板内部湿度，将培养板放入培养箱中培养，每隔两天进行换液。

结肠类器官完全培养基

品牌	产品编号	产品名称	推荐浓度
Gibco	12634028	Advanced DMEM/F12 ()	500 mL
Gibco	25030081	L-Glutamine (200 mM)	2mM
Gibco	15630080	HEPES (1 M)	10mM
Gibco	17504044	B-27™ Supplement (50X)	1X
Gibco	17502001	N-2 Supplement (100X)	1X
PeproTech	315-09	Murine EGF	30ng/ml
PeproTech	250-38	Murine Noggin	50ng/ml
PeproTech	315-32	Murine R-Spondin-1	500ng/ml
PeproTech	315-23	Murine HGF	50ng/ml
PeproTech	315-20	Murine Wnt3a	30ng/ml
BioGems	6169116	N-Acetyl-L-cysteine	1.25mM
BioGems	1293823	Y-27632 (hydrochloride)	10uM
Corning	356231	Matrigel 基质胶低生长因子 无酚红

三、小鼠结肠类器官的传代

       1、当小鼠结肠类器官出芽明显，即可以进行传代处理，弃去原有培养基，每孔加入 1 mL 冰DPBS 溶液，吹散凝固的基质胶，收集到 15mL 离心管中，多个孔可合并处理，收集完后用移液器吹打混匀悬液，通过机械力分离成熟类器官出芽部分；4℃ 300gr/min 离心5min;

       2、小心去除上清液，加入 10 mL 冷 DMEM/F 12 培养基重悬沉淀；4℃ 300gr/min 离心 5min，小心去除干净上清液，按一个孔收集的类器官接种到两个孔中的比例传代，后续操作与结肠隐窝细胞接种步骤相同，在传代培养的前 2 天培养基需要加入 10μM的 Y-27632 小分子化合物，可以增加类器官的存活率。