2014 年Hans.Clever 团队从手术切除的原代肝组织中分离细胞并通过表面标记EPCAM 筛选细胞，使用细胞外基质胶Matrigel，结合细胞因子和小分子化合物的三维类器官培养方法成功的在体外大量扩增了具有双向分化潜能的肝脏干细胞，本文总结了具体的操作方案。

一、实验材料

       1. Advanced DMEM/F12培养基（Thermo, Cat#12634010），
       2. Matrigel类器官培养用基质胶(Corning, Cat#356231)，于冰上分装后保存于-80℃，
       3. B-27™ Supplement (50X) (Thermo, Cat#17504044), 分装后保存于-20℃，
       4. N-2 Supplement (100X) (Thermo, Cat#17502001), 分装后保存于-20℃，
       5. R-spondin-1（PeproTech， Cat#120-38）配制为250μg/ml， 保存于-80℃，使用终浓度为250ng/ml，
       6. Wnt-3a（PeproTech， Cat#315-20）配制为50μg/ml， 保存于-80℃，使用终浓度为50ng/ml，
       7. HGF（PeproTech， Cat#100-39）配制为25μg/ml， 保存于-80℃，使用终浓度为25ng/ml，
       8. FGF-10（PeproTech， Cat#100-26）配制为100μg/ml， 保存于-80℃，使用终浓度为100ng/ml，
       9. Noggin（PeproTech， Cat#120-10C）配制为25μg/ml， 保存于-80℃，使用终浓度为25ng/ml，
       10. EGF（PeproTech， Cat#AF-100-15）配制为50μg/ml， 保存于-80℃，使用终浓度为50ng/ml，
       11. Y-27632 (BioGems, Cat# 1293823)配制为10mM, 保存于-80℃，使用终浓度为10μM，
       12. Forskolin (BioGems, Cat# 6652995)配制为10mM, 保存于-80℃，使用终浓度为10μM，
       13. N-Acetyl-L-cysteine (BioGems, Cat# 6169116)配制为1.25M, 保存于-80℃，使用终浓度为1.25mM，
       14. A83-01 (BioGems, Cat# 9094360)配制为5mM, 保存于-80℃，使用终浓度为5μM，
       15. Gastrin I (BioGems, Cat# 1003377)配制为10μM, 保存于-80℃，使用终浓度为10nM，
       16. Nicotinamide (BioGems, Cat#9899208)配制为10M, 保存于-80℃，使用终浓度10mM，
       17. Accutase消化液(Thermo, Cat#A1110501)。

二、 肝脏组织的消化

       外科手术获取的病人肝脏组织（~1cm3）眼科剪将其剪碎至1mm3大小，胶原酶消化分离肝细胞如下:组织(0.5-1cm3)切碎，用含1%FBS的DMEM培养基洗涤2次，在EBSS缓冲液中加入2.5 mg/ml的胶原酶D和0.1 mg/ml的DNase I配置肝组织消化液， 37℃孵育20~40min后加入含1%FBS的DMEM培养基停止消化，然后用70μm尼龙细胞过滤器过滤悬浮液，过滤液以300-400 g离心5min。细胞沉淀用1%FBS的DMEM培养基重悬，放冰上。滤器膜上剩余的组织碎片加入Accutase 消化液再37℃进一步消化10分钟。然后加入含1%FBS的DMEM培养基停止消化，像上述步骤一样收集重悬细胞。将两种不同组分的细胞悬液混合。

三、肝脏细胞的分离：

       将上述收集的细胞重悬至1*107/ml，按1:100 加入Anti-Human CD326 (EpCAM) Alexa Fluor®488抗体，4℃孵育30min，加入1%FBS的DMEM培养基重悬细胞300-400 g离心5min，弃去上清后用加入1%FBS的DMEM培养基重悬细胞，用流式细胞分选仪对CD326阳性细胞进行分选。

四、 肝脏类器官的培养

       将上述分选后细胞放冰上用基质胶重悬，注意不要打出气泡，吸取50μl基质胶于48孔培养板内，使每孔接种3000 - 10000个细胞，放入37℃培养箱内静置10min，待基质胶凝固后加入500ul肝类器官培养基，肝类器官培养基配置：

Advanced DMEM/F12+1X N2+1XB27++R-spondin1(250ng/mL)+ EGF(50ng/mL)+ FGF10 (100ng/ml)1+ HGF(25ng/ml)+%Glutamax+N-Acetyl-L-cysteine(1.25mM)
+Gastrin(10nM)+ Nicotinamide(10mM) +A83-01(5μM)+Forskolin(10μM)+ Noggin(25ng/ml)+ Wnt3a(25ng/ml)+ Y-27632(10μM), 培养三天后更换类器官培养基，不需要添加Noggin(25ng/ml)+ Wnt3a(50ng/ml)+ Y-27632(10μM)。此后隔天换液，培养7~10天后肝类器官可以成熟。

五、肝类器官的传代

       待细胞培养10天左右可进行传代培养，按1：4~1：8比例进行传代，先在原孔内机械法把细胞吹成小块，然后把细胞转移至15mL 离心管，室温300g，离心5min，弃去上清，添加Accutase，置于37℃培养箱7-10min，直到把细胞消化成单个细胞。室温300g，离心5min，弃尽上清后用Matrigel 进行重悬，待基质胶凝固后加入上述类器官培养基进行培养，每隔天换一次液体。需要留意的是前三天需要用含Y-27632(10μM)的类器官培养基培养，后续培养无需添加Y-27632(10μM)。

表一：诱导培养用细胞因子和小分子

品牌	产品编号	产品名称	规格
PeproTech	120-38	Human R-spondin-1	5μg/20μg/100μg/250μg/500μg/1000μg
PeproTech	AF-100-15	Human EGF	100μg/500μg/1000μg
PeproTech	100-26	Human FGF-10	5μg/25μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1000μg
PeproTech	100-39	Human HGF	2μg/10μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1000μg
PeproTech	120-10C	Human Noggin	5μg/20μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1000μg
PeproTech	315-20	Murine WNT-3A	5μg/10μg
BioGems	1293823	Y-27632	1mg/10mg
BioGems	1003377	Gastrin I	1mg
BioGems	9094360	A 83-01	10mg/25mg
BioGems	6652995	Forskolin	10mg/50mg
BioGems	9899208	Nicotinamide	50mg/100mg
BioGems	6169116	N-Acetyl-L-cysteine	10g/100g