引言：
人肝脏类器官以hESCs/iPSCs 为来源，将其诱导到定型内胚层，再诱导肝谱系特化的阶段（HS），将细胞植入细胞外基质胶中，并且添加类器官培养成分Advanced DMEM/F12 、N2 、B27 、N-Acety-L-Cysteine、Gastrin、Nicotinamide、Glutamax、EGF、R-spondin1、A83-01 和Forskolin，进行3D培养获得肝脏干细胞类器官（hEHOs）。
一、 实验材料
1. 人胚胎干细胞系H9；
2. Matrigel人胚胎干细胞培养用基质胶(Corning, Cat#354277)，于冰上分装后保存于-80℃；
3. Advanced DMEM/F12培养基（Thermo, Cat#12634010）；
4. HM 培养基（ScienCell，Cat#SC-5201）；
5. Matrigel类器官培养用基质胶(Corning, Cat#356231)，于冰上分装后保存于-80℃；
6. Knock Out Serum Replacement(Thermo, Cat#A3181502), 分装后保存于-20℃；
7. B-27™ Supplement (50X) (Thermo, Cat#17504044), 分装后保存于-20℃；
8. N-2 Supplement (100X) (Thermo, Cat#17502001), 分装后保存于-20℃；
9. mTeSR™1 (Stemcell Technologies, Cat#85850)；
10. Activin A(PeproTech, Cat#120-14)配制为100μg/ml, 保存于-80℃，使用终浓度为100ng/ml；
11. R-spondin-1（PeproTech， Cat#120-38）配制为250μg/ml， 保存于-80℃，使用终浓度为250ng/ml；
12. Wnt-3a（PeproTech， Cat#315-20）配制为50μg/ml， 保存于-80℃，使用终浓度为50ng/ml；
13. BMP-4（PeproTech， Cat#120-05）配制为20μg/ml， 保存于-80℃，使用终浓度为20ng/ml；
14. FGF-2（PeproTech， Cat#100-18b）配制为10μg/ml， 保存于-80℃，使用终浓度为10ng/ml；
15. EGF（PeproTech， Cat#AF-100-15）配制为50μg/ml， 保存于-80℃，使用终浓度为50ng/ml；
16. Y-27632 (BioGems, Cat# 1293823)配制为10mM, 保存于-80℃，使用终浓度为10μM；
17. Forskolin (BioGems, Cat# 6652995)配制为10mM, 保存于-80℃，使用终浓度为10μM；
18. N-Acetyl-L-cysteine (BioGems, Cat# 6169116)配制为1.25M, 保存于-80℃，使用终浓度为1.25mM；
19. A83-01 (BioGems, Cat# 9094360)配制为5mM, 保存于-80℃，使用终浓度为5μM；
20. Gastrin I (BioGems, Cat# 1003377)配制为10μM, 保存于-80℃，使用终浓度为10nM；
21. Nicotinamide (BioGems, Cat#9899208)配制为10M, 保存于-80℃，使用终浓度10mM；
22. Accutase消化液(Thermo, Cat#A1110501)。
二、 ESCs/iPSC培养传代步骤
1. hESCs的复苏：预先将Matrigel（Cat#354277）从-80℃取出，置于冰上融化，随后用预冷的DMEM/F1培养基稀释100倍，取1ml加入六孔板一个孔，晃匀至铺满孔板底部。六孔板置于37℃培养箱中至少30min，备用。mTesR1人胚胎干细胞培养基提前从4℃冰箱取出，室温放置约10min。从液氮冻存盒中取出H9细胞(hESC细胞系)，快速移入37℃水浴锅中融化，轻柔晃动至冻存管还剩小块冰即取出，小心将细胞转入15ml离心管，加入５ml mTesR1培养基轻轻混匀细胞，1000rmp/5min离心，小心弃去上清，加入含10μM的Y-27632的mTesR1培养基重悬细胞，细胞接种于基质胶包被的培养板，置于37℃培养箱中培养。次日加入DMEM/F12培养基轻柔洗一次，更换新鲜不含Y-27632的mTesR1培养基，置于37℃培养箱中继续培养。
2. hESCs的培养：每天更换新鲜mTesR1培养基前应观察细胞状态，若发现大量死细胞漂浮于培养基（刚复苏的细胞状态较差），则弃去培养基，加入预热的DMEM/F12培养基轻柔洗细胞一次，弃去DMEM/F12培养基，加入新鲜mTesR1培养基，置于37℃培养箱中继续培养。
3. hESCs的传代：细胞约3~5天生长至80%汇合度，状态良好的hESCs克隆明显，边缘光滑。细胞传代时根据实验需要提前用Matrigel包被培养板，传代比例为1：5~1：10，细胞用DMEM/F12培养基洗2次，在六孔板每孔中加入1ml Accutase消化液，置于37℃培养箱中消化3~5min。每隔2min在倒置显微镜下观察细胞，待克隆边缘发亮即小心弃去消化液，加入2ml含含10μM的Y-27632的mTesR1培养基轻柔吹打细胞数次，收集细胞于15ml离心管，1000rmp/5min离心，小心弃去上清，加入含10uM的Y-27632的mTesR1培养基重悬细胞，转入基质胶包被的培养板，置于37℃培养箱中继续培养。过夜后更换新鲜的不含Y-27632的mTesR1培养基，置于37℃培养箱中继续培养，每天换液。
4. hESCs的冻存：冻存液为含5~10％二甲基亚砜（DMSO）的血清替代品(KOSR)，置于４°Ｃ备用。按照前述细胞传代的方法收集细胞，用细胞冻存液轻柔重悬细胞，转入冻存管，做好标记，置于冻存盒，-80℃过夜后转入液氮中长期保存。
三、H9 细胞系向肝干/祖细胞诱导分化
1. 待H9 细胞在孔内融合度达到70-80%左右，细胞可进行诱导。按上述hESCs的传代步骤操作，用Accutase消化液把细胞消化成单个细胞，按1×10
5 密度进行接种，加入含10μM Y-27632 的TeSR-E8 培养基。
2. 待24h细胞贴附后，将细胞培养基更换为RPMI1640，添加1X B27，100ng/mL Activin A，50ng/mL Wnt3a，使细胞向定性内胚层阶段进行诱导分化。
3. 隔日弃去废液，将细胞培养基更换为RPMI1640，添加1X B27，100ng/mL Activin A 作用一天。
4. 隔日弃去废液，将细胞培养基更换为RPMI1640，添加1X B27，100ng/mL Activin A 再作用一天。定性内胚层阶段诱导结束，向肝干/祖细胞阶段进行诱导。
5. 隔日弃去废液，将细胞培养基更换为Hepatocyte medium（HM），添加10ng/mL FGF-2，20ng/mL BMP-4，共作用5 天，每隔2 天换一次液体，肝干/祖阶段细胞诱导结束。
四、肝脏类器官的扩增培养
1. 肝干/祖阶段作用结束后，用1×PBS 洗两遍，然后用0.25%Trypsin-EDTA 消化成单个细胞，用含胎牛血清的培养基终止消化, 室温1000rpm，离心5min。
2. 将离心好的细胞弃尽上清后用Matrigel 进行重悬，每孔按3,000-10,000 密度接种，以每孔50μL 的液滴接种于24 孔板中，置于37℃培养箱孵育10min。
3. 待胶凝固后，往孔内添加500μl 扩增培养基。肝脏类器官扩增及传代培养基配制：Advanced DMEM/F12+1X N2+1XB27++R-spondin1(250ng/mL)+ EGF(50ng/mL)+1%Glutamax+N-Acetyl-L-cysteine(1.25mM)
+Gastrin(10nM)+ Nicotinamide(10mM) +A83-01(5μM)+Forskolin(10μM) 。
4. 每隔两天更换一次培养基，吸取培养基时用移液枪轻轻地沿孔壁一侧吸取培养基，更换新鲜培养基时缓慢沿孔壁一侧加入，不要把胶吹散。
五、肝脏类器官的传代
1. 待细胞培养10天左右可进行传代培养，按1：6~1：8比例进行传代，先在原孔内机械法把细胞吹成小块，然后把细胞转移至15mL 离心管。
2. 室温300g，离心5min，弃去上清，添加Accutase，置于37℃培养箱7-10min，直到把细胞消化成单个细胞。
3. 室温1000rpm，离心5min，弃尽上清后用Matrigel 进行重悬，待基质胶凝固后加入上述扩增培养基进行培养，传代培养基也为扩增培养基，接种方法如上所述。每隔两天换一次液体。
表一：诱导培养用细胞因子和小分子
品牌
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产品编号
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产品名称
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规格
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PeproTech
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120-14
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Human/Murine/Rat Activin A
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2μg/10μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1000μg
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PeproTech
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120-05ET
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Human BMP-4
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2μg/10μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1000μg
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PeproTech
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100-18B
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Human FGF-2
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20μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1000μg
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PeproTech
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AF-100-15
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Human EGF
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100μg/500μg/1000μg
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PeproTech
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120-38
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Human R-spondin-1
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5μg/20μg/100μg/250μg/500μg/1000μg
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PeproTech
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315-20
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Murine WNT-3A
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5μg/10μg
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BioGems
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1293823
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Y-27632
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1mg/10mg
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BioGems
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1003377
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Gastrin I
|
1mg
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BioGems
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9094360
|
A 83-01
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10mg/25mg
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BioGems
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6652995
|
Forskolin
|
10mg/50mg
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BioGems
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9899208
|
Nicotinamide
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50mg/100mg
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BioGems
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6169116
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N-Acetyl-L-cysteine
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10g/100g
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