引言：

       肾脏类器官的培养首先用高浓度的CHIR99021刺激HIPSC进行2Ｄ培养，促进其向原条中胚层分化，随后加入CHIR99021、FGF-9因子诱导其向间介中胚层分化；最后将细胞团转入Transwell小室内进行为期12天的3D立体诱导，最终获得肾脏类器官。

一、实验材料

       1. Matrigel人胚胎干细胞培养用基质胶(Corning, Cat#354277)，于冰上分装后保存于-80℃；
       2. APEL 干细胞分化培养基（Stemcell，Cat#05271）；
       3. Knock Out Serum Replacement(Thermo, Cat#A3181502), 分装后保存于-20℃；
       4. mTeSR™1 (Stemcell Technologies, Cat#85850)；
       5. FGF-9(PeproTech, Cat#100-23)配制为200μg/ml, 保存于-80℃，使用终浓度为200ng/ml；
       6. Y-27632 (BioGems, Cat# 1293823)配制为10mM, 保存于-80℃，使用终浓度为10μM；
       7. CHIR99021 (BioGems, Cat# 2520691)配制为8mM, 保存于-80℃，使用终浓度为8μM；
       8. Accutase消化液(Thermo, Cat#A1110501)。

二、 ESCs/iPSC培养传代步骤

       1. hESCs的复苏：预先将Matrigel（Cat#354277）从-80℃取出，置于冰上融化，随后用预冷的DMEM/F12培养基稀释100倍，取1ml加入六孔板一个孔，晃匀至铺满孔板底部。六孔板置于37℃培养箱中至少30min，备用。mTesR1人胚胎干细胞培养基提前从4℃冰箱取出，室温放置约10min。从液氮冻存盒中取出H9细胞(hESC细胞系)，快速移入37℃水浴锅中融化，轻柔晃动至冻存管还剩小块冰即取出，小心将细胞转入15ml离心管，加入５ml mTesR1培养基轻轻混匀细胞，1000rmp/5min离心，小心弃去上清，加入含10μM的Y-27632的mTesR1培养基重悬细胞，细胞接种于基质胶包被的培养板，置于37℃培养箱中培养。次日加入DMEM/F12培养基轻柔洗一次，更换新鲜不含Y-27632的mTesR1培养基，置于37℃培养箱中继续培养。
       2. hESCs的培养：每天更换新鲜mTesR1培养基前应观察细胞状态，若发现大量死细胞漂浮于培养基（刚复苏的细胞状态较差），则弃去培养基，加入预热的DMEM/F12培养基轻柔洗细胞一次，弃去DMEM/F12培养基，加入新鲜mTesR1培养基，置于37℃培养箱中继续培养。
       3. hESCs的传代：细胞约3~5天生长至80%汇合度，状态良好的hESCs克隆明显，边缘光滑。细胞传代时根据实验需要提前用Matrigel包被培养板，传代比例为1：5~1：10，细胞用DMEM/F12培养基洗2次，在六孔板每孔中加入1ml Accutase消化液，置于37℃培养箱中消化3~5min。每隔2min在倒置显微镜下观察细胞，待克隆边缘发亮即小心弃去消化液，加入2ml含含10μM的Y-27632的mTesR1培养基轻柔吹打细胞数次，收集细胞于15ml离心管，1000rmp/5min离心，小心弃去上清，加入含10uM的Y-27632的mTesR1培养基重悬细胞，转入基质胶包被的培养板，置于37℃培养箱中继续培养。过夜后更换新鲜的不含Y-27632的mTesR1培养基，置于37℃培养箱中继续培养，每天换液。
       4. hESCs的冻存：冻存液为含5~10％二甲基亚砜（DMSO）的血清替代品(KOSR)，置于４°Ｃ备用。按照前述细胞传代的方法收集细胞，用细胞冻存液轻柔重悬细胞，转入冻存管，做好标记，置于冻存盒，-80℃过夜后转入液氮中长期保存。

三、 肾脏类器官诱导方案的选择

       1. 原条中胚层(PS)阶段的诱导（Day0-Day3）：待H9细胞在孔内融合度达到60-80%左右，细胞可进行诱导。按上述hESCs的传代步骤操作，用Accutase消化液把细胞消化成单个细胞，按2×104/cm2 密度进行接种，加入含8μM CHIR99021的APEL细胞分化培养基，吹打混匀，以此浓度维持培养３天，在第1.5天时进行一次换液。
       2. 间介中胚层（IM）阶段的诱导（Day3-Day6）：PS阶段形成后，更换为含200ng/ml FGF-9和1μg/ml heparin的APEL细胞分化培养基,，吹打混匀，培养３-5天，隔天换液一次。
       3. IM细胞转入３Ｄ培养（Day6）：进将Day7获得的细胞用0.05%胰酶消化３分钟，用DMEM培养基中和消化后，对获得的细胞悬液进行细胞计数。按照大约每个类器官0.5X106个细胞的量，将含有该数目细胞的悬液分装到各个15ml离心管中，配平后进行离心，400g离心2min。离心结束后用细胞铲刮取滴管底部的细胞团。注意，细胞团的完整性对于后续诱导能否成功具有至关重要的影响作用，因此此步骤一旦发生细胞团部分松散，则必须以同样离心速度再次离心后再尝试刮取。若再次失败，建议进行第三次尝试或放弃该细胞。将细胞团从离心管底部刮下后，将其吸入滴管内，转移到Transwell小室中4μm的膜上。
       4. IM细胞向成熟的UB或ＭＭ细胞方向过渡（Day6-Day13）：再上述Transwell小室底部加入含5μM CHIR99021APEL培养基（大约1.3ml）刺激1h，使培养基液面刚好浸没Transwell膜的底部,刺激后再培养基内添和200ng/ml FGF-9和1μg/ml heparin。在剩余的一周内，仅用同浓度的FGF9和heparin进行培养。每天上下午两次摇动六孔板，使培养基获得一定的流动性，防止局部代谢废物堆积；每２天换液一次，防止液体蒸发导致的类器官干涸。
       5. 肾脏细胞进一步成熟（Day13-Day18）：在后续的诱导过程中，换用不含任何诱导因子的APEL培养基，继续培养6天。注意事项同上步。