2011年，Hans Clevers等首先报道了成人小肠类器官的构建方法，培养及分化的人小肠类器官分别具有小肠上皮组织隐窝和绒毛区域细胞的特征，小肠类器官与小肠上皮组织在细胞组成和形态结构上高度相似，并具有良好的短肽吸收和离子转运功能。人小肠类器官的培养条件与小鼠小肠类器官不同，除了加入基本生长因子外(EGF, Noggin，R-Spondin-1, Wnt-3a)，还需要添加一些激素和维生素类物质，如胃泌素(gastrin)和烟酰胺(Nicotinamide)，可以延长类器官的存活时间，另外加入A83- 01和SB202190，可以抑制类器官的死亡，提高类器官形成率。在这样的培养条件下，人小肠类器官呈现出芽状结构，增殖的干细胞处于出芽部位，小肠类器官经过传代培养，可以存活6个月以上，并且可以保持基因型不变。以上培养条件可用于人类肠道类器官的长期培养与扩增，但却不能像小鼠类器官那样可以分化为各种肠上皮细胞，在上述培养条件的基础上去除Wnt3A、Nicotinamide和SB202190，同时加入DAPT小分子，则可以诱导肠干细胞分化为各种终末分化结肠上皮细胞。人小肠类器官模型的建立，有望推动小肠生理与疾病基础研究的发展并且在药物开发、个体化治疗、基因治疗以及再生医学等方面具有巨大的应用前景。

2. 用镊子轻刮标本黏膜面去除黏液，将小肠组织标本转移至盛10cｍ细胞培养皿上，加入一定量的DPBS。

3. 使用灭菌弯尖眼科剪，将组织标本剪碎，直至组织块直径小于１ｍｍ,使用预冷1%BSA溶液润洗移液管管壁后，将组织块转移至15mL离心管中。待组织块沉淀后，吸除上清液，加入10mL预冷DPBS, 重悬8-10次。按上述方法漂洗 3-5次，直至上清变澄清。

4. 去除上述澄清液。加入3mL解离缓冲液，使用预冷1%BSA溶液润洗移液管管壁后，将重悬液转移至 6孔细胞培养板中，并加入300μL EDTA(50mM)。冰上震荡消化30min左右，直至大部分隐窝游离。在显微镜下观察，游离的隐窝呈＂腊肠样＂，隐窝原所在位置呈＂甜甜圈样。

小肠隐窝消化液：2-5mM的EDTA, 此步骤后可以让组织碎片自然沉降后去除上清，继续消化一次

5. 收集消化后的溶液，让组织碎片通过重力沉降约1min。小心吸出并丢弃消化液，留下足够的液体以没过组织碎片。

6. 将组织碎片重悬于预冷的解离缓冲液，并用移液管上下吹打三次。静置直到大部分肠组织碎片沉降到底部。

7. 小心吸取上清液并使用70μm滤网过滤，将滤液收集于干净的50mL管中。

8. 重复上述6-7步骤几次，直至上清中没有隐窝，将几次获得上清收集在一起。

9. 在2-8℃下将上述收集的上清以200×g离心3分钟。小心地倒出并丢弃上清液。

10. 将沉淀重悬于含有10mL解离缓冲液中。200×g离心3分钟。轻轻倒出上清液。将肠隐窝沉淀留在管中。根据沉淀量加入适当体积的基础培养基重悬沉淀，如果单细胞过多，可再次离心，收集上清以去除单细胞。

11. 计数，吸取10μL置于玻璃载玻片或血细胞计数器上。使用倒置显微镜，计数10μL样本中的隐窝数量，200g离心5min，小心吸出并弃去上清。

12.用类器官培养基将隐窝的密度重悬至8-20个/μL，取出150μL隐窝悬液，加入等体积的未稀释的基质胶混合隐窝，小心地上下吹打十次以充分混匀，注意避免产生气泡。

13. 吸取50μL悬液，加入到提前预热的24孔板每个孔中的中心部位，样品应在每个孔的中心形成圆顶结构。为了防止接种时出现气泡，枪头内液体不要全部打出。

14. 将培养板在37℃下静置10分钟以待基质胶完全凝固。将平板转放入培养箱时，应注意不要破坏凝固后的液滴。

15. 使用移液枪沿着孔侧壁向每个孔中轻轻地加入500μL室温(15-25℃)的配制的类器官扩增培养基。不要将培养基从圆顶结构上直接加入。

16. 向其它未接种的孔中加入无菌PBS以保证培养时的湿度。 将培养板的盖子盖好，并在37℃和5％CO₂下进行培养。

17. 隔天进行完全换液。换液时将移液枪头放在孔底边缘小心地将原有液体培养基吸出，并加入为500μL新鲜的室温类器官培养基。

18. 对于原代培养物，7-14天进行传代，对于已经传代的类器官，每7-10天传代一次，以1：3~1：5的比例进行类器官传代，以避免在类器官过度生长和空腔内积累过量的碎屑。

❼ 购买的基质胶在冰上融化后分装冻存，操作过程中基质胶一定要放在冰上，未用完的液体状基质胶可以冻存，若凝固后请弃去。