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成人小肠类器官的培养与分化
发布时间:2022-04-18

2011年,Hans Clevers等首先报道了成人小肠类器官的构建方法,培养及分化的人小肠类器官分别具有小肠上皮组织隐窝和绒毛区域细胞的特征,小肠类器官与小肠上皮组织在细胞组成和形态结构上高度相似,并具有良好的短肽吸收和离子转运功能。人小肠类器官的培养条件与小鼠小肠类器官不同,除了加入基本生长因子外(EGF, Noggin,R-Spondin-1, Wnt-3a),还需要添加一些激素和维生素类物质,如胃泌素(gastrin)和烟酰胺(Nicotinamide),可以延长类器官的存活时间,另外加入A83- 01和SB202190,可以抑制类器官的死亡,提高类器官形成率。在这样的培养条件下,人小肠类器官呈现出芽状结构,增殖的干细胞处于出芽部位,小肠类器官经过传代培养,可以存活6个月以上,并且可以保持基因型不变。以上培养条件可用于人类肠道类器官的长期培养与扩增,但却不能像小鼠类器官那样可以分化为各种肠上皮细胞,在上述培养条件的基础上去除Wnt3A、Nicotinamide和SB202190,同时加入DAPT小分子,则可以诱导肠干细胞分化为各种终末分化结肠上皮细胞。人小肠类器官模型的建立,有望推动小肠生理与疾病基础研究的发展并且在药物开发、个体化治疗、基因治疗以及再生医学等方面具有巨大的应用前景。



.成人小肠类器官原代培养及扩增体系的构建


1. 肠道手术或肠镜活检取得的正常肠组织标本保存于4 ℃的Dulbecco′s磷酸盐缓冲液(DPBS)中运输,用4 ℃含青霉素和链霉素的DPBS反复冲洗标本至洗涤液澄清。

2. 用镊子轻刮标本黏膜面去除黏液,将小肠组织标本转移至盛10cm细胞培养皿上,加入一定量的DPBS。

3. 使用灭菌弯尖眼科剪,将组织标本剪碎,直至组织块直径小于1mm,使用预冷1%BSA溶液润洗移液管管壁后,将组织块转移至15mL离心管中。待组织块沉淀后,吸除上清液,加入10mL预冷DPBS, 重悬8-10次。按上述方法漂洗 3-5次,直至上清变澄清。

4. 去除上述澄清液。加入3mL解离缓冲液,使用预冷1%BSA溶液润洗移液管管壁后,将重悬液转移至 6孔细胞培养板中,并加入300μL EDTA(50mM)。冰上震荡消化30min左右,直至大部分隐窝游离。在显微镜下观察,游离的隐窝呈"腊肠样",隐窝原所在位置呈"甜甜圈样。

小肠隐窝消化液:2-5mM的EDTA, 此步骤后可以让组织碎片自然沉降后去除上清,继续消化一次

5. 收集消化后的溶液,让组织碎片通过重力沉降约1min。小心吸出并丢弃消化液,留下足够的液体以没过组织碎片。

6. 将组织碎片重悬于预冷的解离缓冲液,并用移液管上下吹打三次。静置直到大部分肠组织碎片沉降到底部。

7. 小心吸取上清液并使用70μm滤网过滤,将滤液收集于干净的50mL管中。

8. 重复上述6-7步骤几次,直至上清中没有隐窝,将几次获得上清收集在一起。

9. 在2-8℃下将上述收集的上清以200×g离心3分钟。小心地倒出并丢弃上清液。

10. 将沉淀重悬于含有10mL解离缓冲液中。200×g离心3分钟。轻轻倒出上清液。将肠隐窝沉淀留在管中。根据沉淀量加入适当体积的基础培养基重悬沉淀,如果单细胞过多,可再次离心,收集上清以去除单细胞。

11. 计数,吸取10μL置于玻璃载玻片或血细胞计数器上。使用倒置显微镜,计数10μL样本中的隐窝数量,200g离心5min,小心吸出并弃去上清。

12.用类器官培养基将隐窝的密度重悬至8-20个/μL,取出150μL隐窝悬液,加入等体积的未稀释的基质胶混合隐窝,小心地上下吹打十次以充分混匀,注意避免产生气泡。

13. 吸取50μL悬液,加入到提前预热的24孔板每个孔中的中心部位,样品应在每个孔的中心形成圆顶结构。为了防止接种时出现气泡,枪头内液体不要全部打出。

14. 将培养板在37下静置10分钟以待基质胶完全凝固。将平板转放入培养箱时,应注意不要破坏凝固后的液滴。

15. 使用移液枪沿着孔侧壁向每个孔中轻轻地加入500μL室温(15-25℃)的配制的类器官扩增培养基。不要将培养基从圆顶结构上直接加入。

16. 向其它未接种的孔中加入无菌PBS以保证培养时的湿度。 将培养板的盖子盖好,并在37℃和5%CO2下进行培养。

17. 隔天进行完全换液。换液时将移液枪头放在孔底边缘小心地将原有液体培养基吸出,并加入为500μL新鲜的室温类器官培养基。

18. 对于原代培养物,7-14天进行传代,对于已经传代的类器官,每7-10天传代一次,以1:3~1:5的比例进行类器官传代,以避免在类器官过度生长和空腔内积累过量的碎屑。

操作要点
镊子轻刮标本黏膜面去除黏液,否则后续得到的分馏会有很多杂细胞污染。
使用移液管(枪头)前用1%BSA溶液提取润洗,这样可以减少隐窝吸附在移液管(枪头)上,1%BSA可用DMEM培养基配制。
小肠隐窝消化液用5mM的EDTA,注意EDTA是否有析出,如析出太多会影响终浓度,有必要更换新的EDTA。
因分离小肠隐窝需要时间较久,建议整个操作在低温进行,离心机调至4℃,所用试剂溶液放冰上预冷。
EDTA消化后,小肠组织会变松散,在外界机械力作用下,小肠隐窝会从组织中分离出来,可以重复几次通过外界机械力作用得到不同的分馏组分混合,也可以挑选隐窝含量较高,杂细胞较少的分馏组分种板培养。
得到分馏组分后进行隐窝计数,用完全培养基重悬隐窝至8~20个/μL,加入等体积基质胶混合,该过程一定要在冰上操作,混合过程切勿产生气泡,否则影响后续观察以及隐窝培养状态,混匀过程可以调小量程,吸取的液体不要全部吹出。

购买的基质胶在冰上融化后分装冻存,操作过程中基质胶一定要放在冰上,未用完的液体状基质胶可以冻存,若凝固后请弃去。



二.成人小肠类器官的传代培养


1. 在成熟类器官的24孔板中,每孔加入约1mL预冷的细胞回收液,用1mL枪头吹打板底的基质胶,直到基质胶全部打碎,收集每个孔中的悬液置于15 ml离心管中;
2. 将全部打碎的基质胶悬液冰上震荡消化10min;可用1mL大枪头继续吹打悬液,此过程避免产生气泡(调制量程到700μL可避免气泡产生),可取适量的悬液观察,直至看不到大块的类器官团块为止。
3. 加入10mL预冷的1%BSA溶液进行洗涤,离心弃去上清后用基质胶重悬。基质胶铺板后加入含有Y-27632的小肠类器官扩增培养基。
4. 传代中,若隐窝状态良好可进行1:3传代,若状态较差可进行1:1传代。全程可以维持约6个月的长期传代扩增,且类器官状态保持良好。


三.成人小肠类器官的冻存与复苏


准备冻存液:10%二甲基亚砜(DMSO)+20%胎牛血清(FBS)+70%DMEM/F12。

1. 将需要冻存的类器官冰上放置5~10 min。

2. 收集类器官,步骤同之前传代收集步骤一致。
3. 离心后弃上清,用800μL的冻存培养液重悬,将悬液移至冻存管中,放入冻存盒中于-80℃冰箱中保存24 h,如需长久保存,则24 h后转移至液氮罐保存。
复苏准备:37℃水浴箱

从液氮中取出冻存管后,立即放入37℃水浴中,使之迅速融解。等到冻存管中仅存一小片冰室,迅速将细胞转移到含9mL冷的基础培养基中(先将之置于15ml离心管中,放于冰上)。200g 室温离心5min,弃去上清,加入适量类器官培基重悬后与基质胶混合种板,加入含有Y-27632的小肠类器官扩增培养基。



四.成人小肠类器官的分化培养


在成人小肠类器官培养中,培养基的成分可决定小肠类器官的细胞组成。Wnt是维持小肠干细胞的"干性"、促进小肠干细胞进行自我更新与増殖的关键信号通路。在富含Wnt配体(Wnt-3a)的培养基中,成人小肠类器官主要由LGR5+的干细胞、潘氏细胞及前体细胞组成,而在不含Wnt-3a的培养基中,Wnt信号通路的失活,启动LGR5+的干细胞的分化,使其转化为各种类型的终末端分化的小肠上皮细胞,包括吸收细胞、潘氏细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞等。因此在细胞组成上未分化的成人小肠类器官与小肠上皮隐窝结构趋向于一致,而分化的成人小肠类器官与小肠上皮绒毛结构趋向于一致。

小肠类器官扩增体系建立后,在传代后的第3~5天将扩増培养基更换为分化培养基,在细胞培养箱中培养。每天在显微镜下观察类器官生长情况,每2天更换分化培养基。分化5-7天后可收集分化的成人小肠类器官进行实验。



五.配制小肠类器官扩增培养基


*扩增培养基可以用于人类肠道类器官的长期培养与扩增,但却不能像小鼠类器官那样可以分化为各种肠上皮细胞!


基础培养基:将青-链霉素( 1%) 、10mM HEPES、L-谷氨酰胺(1X)加入至Advanced DMEM/F-12 培养基,第一次种板需要加入Y-27632,后续换液不需要加入Y-27632。



六.配制小肠类器官分化培养基



分化培养基在扩增培养基的基础上去除了WNT-3a,SB2020190,Nicotinamide,加入了DAPT。

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