造血干细胞(Hematopoietic stem cells, HSCs)是一类多能成体干细胞，具有高度增殖潜能、极强的自我更新能力和多向分化潜能等独特的生物学特性，可以分化成各类成熟的血细胞比如共同淋巴祖细胞(common lymphoid progenitors, CLPs)、共同髓系祖细胞(common myeloid progenitors, CMPs)。共同淋巴祖细胞可以产生T、B和NK细胞，共同髓系祖细胞可以产生单核细胞和巨噬细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板和树突状细胞。

造血干细胞有两种祖细胞群体，分别是长期造血干细胞(Long-Term HSC, LT-HSC)和短期造血干细胞(Short-Term HSC, ST-HSC)。LT-HSC具有自我更新的能力，但是ST-HSC没有，ST-HSC可以分化为各种类型的血细胞。随着 HSC 的基础研究不断深入，以 HSC 为载体的针对更多血液疾病和免疫系统疾病的研究会更加广泛, 对HSC的分离和纯化是后续研究的基础，然而HSC在骨髓细胞中的极低（约1/105）占比对其研究带来了巨大挑战。流式细胞术的出现极大推动HSC的功能性研究及其在临床上的应用，流式细胞术（FCM）是一种对处在快速流动中的细胞或其它生物微粒逐个进行多参数的快速定量分析和分选的技术，可以高纯度识别分离稀有细胞群体。本文主要介绍运用流式细胞术分析造血系统细胞的方法，文中推荐有配色方案和染色步骤可供大家参考。

造血干细胞(HSC)能分化为不同类型的造血祖细胞，进一步分化为各种谱系功能成熟的血细胞。MP：多能祖细胞；MEP：红细胞/巨核细胞祖细胞；GMP：粒细胞/巨噬细胞祖细胞；CMP：共同髓系祖细胞；CLP：共同淋系祖细胞；MacP：巨噬细胞祖细胞；GP：粒细胞祖细胞；Mkp：巨核细胞祖细胞；EP：红细胞祖细胞；DC：树突状细胞。

骨髓长期造血干/祖细胞包含有：表面标记为 Lineage-Sca1^-c-Kit⁺的髓系祖细胞 （ MP ） 、 标 记 为 Lineage-Sca1^lowc-Kit^lowCD34⁺ IL-7R⁺ 的 淋 系 共 同 祖 细 胞（CLP）、标记为Lineage-Sca1⁺c-Kit⁺CD34⁺Flt3⁺的骨髓多潜能祖细胞（MPP）、标记为 Lineage-Sca1+c-Kit+CD34-Flt3-的LT-HSC、标记为 Lineage Sca1⁺c-Kit⁺CD34⁺Flt3^-的ST-HSC。

染色方案：

取100µL（浓度为1×10⁸ cell/mL）全骨髓细胞悬液至于流式管中，加入Biotin偶联的7种lineage抗体：CD11b-Biotin、Gr1-Biotin、Ter119-Biotin、IL-7R-Biotin、B220-Biotin、CD4-Biotin、CD8-Biotin（lineage(Lin)标记是HSC来源的各种血细胞和免疫细胞的特异性标记的总称），冰上孵育30min，加入1mL staining medium，400g/min 5min离心弃上清后，加入抗体染色（如下表），用staining medium调整染色体积50-80µL，冰上避光孵育90min，加入300µL 1×lysis buffer室温避光放置3min, 将红细胞裂解充分后，加入1mL staining medium 400g/min 5min离心，弃上清500µL staining medium重新悬浮细胞，300目滤膜过滤后准备流式分析，上机前加入DAPI（储存浓度1µg/µL，使用浓度1µg/mL），每只小鼠收集1×10⁶ 细胞。

在骨髓中，HSC经由多能祖细胞（MPP）分化形成淋系共同祖细胞（CLP），CLP 首先分化为 Pro-B 细胞（B220⁺CD43⁺）），Pro-B 细胞阶段又分为 early pro-B 和 late pro-B，在这两个阶段 B 细胞内部依次发生重链 D-J 重组和 V-DJ 重组，当 Pro-B 开始表达重链时，就分化成为 Pre-B 细胞（B220⁺CD43^-），Pre-B 细胞也分为两阶段，large pre-B 和small pre-B，small pre-B 以细胞开始轻链 V-J 重组为标志，当完成轻链 V-J 重组并在细胞表面表达 IgM 抗原时称为不成熟 B 细胞（immature B，CD43^-B220⁺IgM⁺IgD^-），这时的 B 细胞还需通过自体抗原筛选，能结合自身抗原的B 细胞将在这一步被淘汰，最后通过一系列筛选幸存的 B 细胞表面表达 IgD 抗原，此时称为成熟 B 细胞（mature B，CD43^-B220⁺IgM⁺IgD⁺）。

染色方案：

取20µL（浓度为1×10⁸ cell/mL）全骨髓细胞悬液至于流式管中，抗体染色（如下表），冰上避光孵育30min，加入300µL 1×lysis buffer室温避光放置3min, 将红细胞裂解充分后，加入1mL staining medium 400g/min 5min离心弃上清后，加入250µL staining medium重新悬浮细胞，300目滤膜过滤后准备流式分析，上机前加入DAPI（储存浓度1µg/µL，使用浓度1µg/mL）, 每只小鼠收集5×10⁴ 细胞，计算pre-B cell，immature-B cell，mature-B cell，pre-pro B, pro B各群细胞所占的比例。

小鼠骨髓淋系细胞主要有 T 细胞（主要是 CD4 标记的辅助性 T 细胞（Th 细胞），以及 CD8 标记的细胞毒 T 细胞（Tc 细胞））和 B 细胞（B220 标记），髓系细胞主要有单核细胞，粒细胞（嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞及中性粒细胞）、巨噬细胞、巨核细胞等（以广泛表达的表面抗原 CD11b 来标记）。

染色方案：

取浓度为 10⁸ cell/mL 的全骨髓细胞悬液 20µL 至流式管中，先加 300µL 1×lysis buffer 吹打混匀，室温避光 5min 使红细胞裂解充分，再加入PBS离心去上清，按下表染色方案配制抗体，加入抗体 mix 吹打混匀进行染色，冰上避光孵育 30min，再加入PBS离心去上清，最后加入PBS 重新悬浮细胞，准备流式分析，每只小鼠收集 1 万个细胞，计算T、B、M细胞所占的比例。

Wip1 deficiency impairs haematopoietic stem cell function via p53 and mTORC1 pathways[J]. Nature communications, 2015, 6(1): 6808.

（1）c-Kit+ 富集

将分离得到的骨髓细胞悬液，计数后离心，先加 500µL 1×lysis buffer 吹打混匀，室温避光 5min 使红细胞裂解充分，再加入PBS离心去上清。加入 APC c-Kit (每 108个细胞加 2µL)，冰上避光孵育 30min，再加入PBS离心去上清，加 200µL PBS 重悬细胞，再加入 anti-APC microbeads (每 108个细胞加 5µL)，冰上避光孵育 30min，再加入PBS离心去上清，加入 3mL PBS 重悬细胞。将磁柱固定于磁力架的吸附柱上，用 PBS 润湿磁柱，将重悬的细胞经过 300 目的滤膜过滤到磁柱中，待细胞悬液流尽立即加入 3mL PBS 清洗两次后，待液体即将流尽，将磁柱从磁力架上取下，加入 3mL PBS 到磁柱中，将细胞打入到 15mL EP 管中3次，此时 EP 管中打下的细胞即为 c-Kit+细胞。

（2）分选染色

将 c-Kit+离心弃上清。先加入 Biotin 偶联的 7 种 lineage抗体 （同上）mix，冰上避光孵育 30min，再加入PBS离心去上清，再按下表染色方案加入二抗 mix，冰上避光孵育 30min，再加入PBS离心去上清，最后加入 500µL PBS 重悬细胞，300 目滤膜过滤后准备流式分选。