引言

细胞凋亡，也称细胞程序性死亡，是指在一定的生理或者病理条件下，细胞主动的、高度有序的、自己结束其生命的过程。细胞凋亡是生物体中一种普遍存在的现象，胚胎形成、个体发育、衰老和损伤细胞的清除等都与细胞凋亡密切相关。检测细胞凋亡的方法很多，如电子显微镜或者光学显微镜下的形态学观察、细胞DNA提取物的DNA梯状带电泳实验等。而流式细胞术是非常重要的检测细胞凋亡的方法，不仅可以定性，也可以定量。

一、流式检测细胞凋亡

细胞凋亡可分为早期凋亡（细胞膜结构发生变化，磷酯酰丝氨酸外翻）、早中期凋亡（细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素c、到胞浆）、中晚期凋亡（细胞凋亡的信号转导）、晚期凋亡/坏死细胞（DNA降解为180-200bp片断）。正常细胞膜的磷脂分布是不对称的，活细胞中磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine, PS)位千细胞膜的内表面，细胞凋亡时，细胞膜发生变化， PS从细胞膜的内表面翻转到细胞膜的外表面。Annexin V是一种对PS有高度亲和力的、钙依赖性的磷脂结合蛋白，Annexin V可以特异性地识别凋亡细胞表面的PS, 而活细胞的PS位千细胞膜的内表面，无法与Annexin V特异性结合。因此该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS，PS的外翻不是凋亡细胞所独特的，也可发生在坏死的细胞中。两种细胞死亡方式间的差别在于细胞凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。PI或7-AAD染料可以通过细胞膜进入胞内与DNA结合。据此可以建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合PI或7-AAD染料来检测细胞膜的完整性的检测方法。

图1.流式凋亡检测

1、Annexin-V-PI+——细胞发生机械损伤，细胞膜破损严重，Annexin-V染不上。
2、Annexin-V+PI+——细胞膜已经受损，PI染料可进入胞内与DNA结合，此时细胞已进入晚期凋亡或已经坏死，不可逆转。
3、Annexin-V-PI-——真正的活细胞，对Annexin-V和PI都拒染。
4、Annexin-V+PI-——细胞只有PS外翻，细胞膜完整，对PI拒染，此时细胞只发生前凋亡，在撤走诱导因素下，可能逆转凋亡。

二、流式凋亡检测注意事项

1、检测贴壁细胞时，若不好控制消化时间，建议用Accutase细胞消化液，对细胞损伤小且不会改变细胞膜上PS的分布。

2、选择Annexin-V的荧光染料时要考虑细胞的自发荧光，特别是培养时间久或药物处理的细胞，一定注意细胞代谢物药物本身的荧光，一般来说细胞代谢物的自发荧光会干扰FITC/PE，所以可建议用Annexin-V APC，药物的干扰可查看药物本身的发射光谱是否会对检测选择的染料有影响。

3、细胞染色完成后，禁止固定，尽快检测完，可将检测管放冰上，可减少外界环境对检测结果的影响。

4、实验设计时，要考虑到补偿，设全单染管调节补偿，若是有不同的处理组，设置单染管时可从每个组中分别取一点细胞混合来染色。

5、若是第一次做药物对细胞凋亡影响的实验，建议做阳性对照组，可选择用Etoposide来诱导凋亡做为阳性对照。

6、在做凋亡统计时一般指统计前凋亡，因为只有前凋亡才有意义，当然也有文献统计总的凋亡比例（前凋亡和晚期凋亡之和），单纯的统计晚期凋亡比例意义不大。

三、线粒体膜电位检测细胞凋亡

JC-1是一种亲脂性阳离子荧光染料，有单体和多聚体两种存在状态，低浓度时，以单体存在，可检测到绿色荧光，用流式检测时，通常为FL-1通道(和FITC同通道）高浓度时，以多聚体存在，可检测到红光，流式检测通常为FL-2通道（和PE同通道)。正常细胞，膜电位正常时，JC-1通过线粒体膜极性进入线粒体内，并因浓度升高而形成发射红色荧光的多聚体，而凋亡细胞，往往伴随着线粒体跨膜电位的破坏，JC-1从线粒体内释放，浓度降低，逆转为发射绿色荧光的单体形式。故而可以通过检测绿色和红色荧光来定性(细胞群的偏移）定量（细胞群的荧光强度）的检测线粒体膜电位的变化。线粒体膜电位的下降被认为是细胞凋亡过程中最早发生的生物学变化。一旦线粒体膜电位被破坏，细胞凋亡将不可逆转。

图2.线粒体膜电位检测（左图膜电位正常为多聚体，细胞正常；中图出现膜电位开始降低，出现单体，有凋亡细胞；右图膜电位都降低了，JC-1以单体存在，都为凋亡细胞）

四、tunel法检测细胞凋亡

细胞在发生凋亡时会激活一些DNA内切酶，这些内切酶可以使染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的催化下加上荧光素标记的dUTP (fluorescein-dUTP)，从而可通过荧光显微镜或者流式细胞仪对凋亡细胞的检测，在正常细胞或正在增殖的细胞中几乎不发生DNA的断裂，也就没有3'-OH的形成，TUNEL检测后很少能够被染色，这就是TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling) 法检测细胞凋亡的原理。

tunel法检测细胞凋亡注意事项
（1）出现非特异性荧光标记，有些细胞或组织，例如平滑肌细胞或组织，nuclease或polymerase的酶活性水平较高，易导致出现非特异性的荧光标记。解决方法是，取细胞或组织后立即固定并且要充分固定，以阻止这些酶导致假阳性。
（2）红细胞中血红蛋白导致的自发荧光产生严重干扰。此时宜选择其它细胞凋亡检测试剂盒。
（3） 防止荧光淬灭，荧光染料在普通光照10分钟就会严重淬灭，因此染色过程需要避光操作。

五、活化的caspase-3检测细胞凋亡
凋亡细胞中，32kD 的原酶(Pro-caspase-3)裂解为一个17kD 亚单位和一个12kD 亚单位，两个亚单位形成二聚体，即为活化的Caspase-3。Caspase-3 在早期凋亡细胞中就已经活化，是凋亡程序中的重要的Caspase 酶，形成异二聚体，可被Anti-Active Caspase-3抗体特异性识别。用荧光素标记Anti-Active Caspase-3抗体即可检测到活化的Caspase-3，检测时细胞需要固定破膜。

图3.横坐标为活化的Caspase-3强度，左图为正常组细胞，右图为发生凋亡的细胞，阳性比例为14.2%

活化的caspase-3检测注意事项
（1）固定破膜之后细胞会损失，前期可以多收集一些细胞。
（2）某些凋亡诱导剂引起的细胞凋亡可能存在非依赖于Caspase-3活化机制。

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